导读：引起抗体ELISA检测阳性对照不成立的原因有很多，可“人机料法环”各环节排查；本文总结了最常见的几种原因，包括：1．试剂盒过期、运输保存不当；导致试剂失效；2．ELISA试剂盒使用前未充分回温，导致抗原抗体结合异常；3．没有按说明书规定进行样品稀释（阴阳对照）、溶液配制，洗涤液应使用纯净水或蒸馏水配制；严格按照说明书操作；4．定期进行设备校准（移液器、恒温箱、酶标仪等）；避免因设备造成试验结果异常。尤其第4点，较多实验室有所疏忽。

一例ELISA抗体检测阳性对照不成立排查及处置方案

作者丨广州悦洋生物技术有限公司 高小鹏老师

客户反馈：

在使用悦洋牛分枝杆菌抗体ELISA试剂盒时，重复检测2次，阳性对照仍然不成立，即阳性对照OD₆₃₀在0.8左右，而说明书要求≥1.05。

图1：阴阳性对照排版及OD₆₃₀读取结果

图2：阴阳性对照排版及OD₆₃₀读取结果（原样品复核）

客户猜测：

由于ELISA操作经验少，是否在操作过程中细节没做到位导致，或者运输过程中阳性对照降解导致；实验室前期使用酶标仪测试毒素，结果无异常。

一、数据查看及分析

1．操作过程：根据显色情况，可排除显色液添加异常（A液/B液），单独加A液/B液应不显色；

2．复核结果分析：为防止因试剂盒失效导致试验不成立，打开未开封试剂盒复测，结果阳性OD在0.85左右，仍然不成立；但眼观蓝色的4个样品结果均一致；

3．检测数据分析：阴性对照及阳性对照（图1/图2红框），重复性较好；阳性OD为0.76，但对应的酶标孔色泽较深，为深蓝色，与读取预期不符。

二、异常原因分析

1．异常分析：从质量管理的“人机料法环”五个环节逐一排除。

2．人/法（人员及操作方法）：操作不规范导致实验不成立；跟进核实客户每一步操作，严格控制孵育时间、温度，确保操作无异常；

3．机（酶标仪）：通过对色素按比例稀释，获得已知背景OD₆₃₀值，在客户酶标仪复核；

4．物料（试剂盒）：长时间运输中，可能造成试剂某些成分降解或失效；选择该批次公司试剂盒留样质检，查看结果；已核实样品保存、状态均无异常；

5．环（环境）：试剂盒保存温度、恒温箱温度、操作环境是否符合；室温应在25±3℃。

三、异常排除方案

本次复核要点在于：①、酶标仪读取是否存在异常；②、试剂盒本身是否存在异常；③、操作是否规范。

准备并按比例稀释色素，通过实验室酶标仪测试，获得已知背景OD₄₅₀/OD_630值；在客户酶标仪复测（图3）：结果显示在OD₄₅₀无显著差异，但在OD₆₃₀具有明显差异，应是酶标仪OD₆₃₀长时间未校准，滤光片老化导致试验结果异常。

图3：OD₆₃₀吸光度核验

2．试剂盒异常排查：携带与客户同批次产品，测试样品，排查检测性能差异，见图4，图4-A/B为悦洋实验室复核阳性对照结果，阳性OD值为1.9左右，符合说明书要求；图4-C/D为新出库该批次试剂盒，客户实验室检测样品，阳性对照0.8，与前两次无显著差异；表明试剂盒性能正常，同时也核实客户操作无异常。

图4：试剂盒验证结果

3.排查结果：酶标仪故障，滤光片需要校准维护。

四、悦洋观点：

一般引起抗体ELISA检测阳性对照不成立的原因有很多，可“人机料法环”各环节排查；最常见的原因可能有下面几点：

1．试剂盒过期、运输保存不当；导致试剂失效；

2．ELISA试剂盒使用前未充分回温，导致抗原抗体结合异常；

3．没有按说明书规定进行样品稀释（阴阳对照）、溶液配制，洗涤液应使用纯净水或蒸馏水配制；严格按照说明书操作；

4．定期进行设备校准（移液器、恒温箱、酶标仪等）；避免因设备造成试验结果异常。

五、酶标仪维护、自检与校准

因实验室酶标仪长期缺乏有效维护，内部亦无自检的方案，而外部设备企业也未进行定期校准，最终导致试验结果异常甚至不成立；以下是悦洋对于酶标仪使用维护的小Tips：

1．酶标仪维护：

①　仪器应放置在无磁场和干扰电压，低于40分贝的环境下，保证台面稳定无强烈振动；

②　应避免阳光直射以防止设备老化；

③　操作时环境温度应在15℃－40℃之间，环境湿度在15％－85％之间；

④　运行中操作电压应保持稳定；

⑤　操作环境空气清洁，避免水汽，烟尘；

⑥　保持干燥、干净、水平的工作台面，足够大的操作空间；

⑦　仪器表面及内部需保持清洁，如不慎将样品或试剂洒到了仪器表面或内部，请及时清理；

⑧　请勿在检测过程中关闭电源；

⑨　在使用后，请及时关闭仪器并盖好防尘罩；

⑩　出现技术故障时应及时与厂家联系，切勿擅自拆卸酶标仪

2．酶标仪自检与校准：

①　酶标仪性能：反应酶标仪性能的指标主要有测定波长范围，滤光片配置，检测速度，吸光度范围，线性范围，分辨率，准确度，精密度等，一般可联系酶标仪技术人员获得相关资料。

②　标准物质准备：可自行配制重铬酸钾溶液或购买对应波长的标准干涉滤光片（有标准物质证书），图5。

检查项目：如图6/7所示，可根据《JJG 861-2007酶标分析仪检定规程》，根据本实验室需求自检；

图5：标准物质准备

图6：酶标仪自检项目

图7：酶标仪性能判定

4.酶标仪的校准：酶标仪若长期未使用，在使用前应按照（检测/校准）方法的要求对其进行符合性验证，包括功能验证与计量特性验证；方法包括校准方式与核查方式；仪器校准一般由酶标仪技术人员完成；

5.处置小结：按照排查－复核一再排查一再复核的思路，实验室应有自建样品盘体系供核查，或准备标准物质（不同浓度色素或标准滤光片，比较与已知背景值的差异）。

√ 留样复检：不符合

√ 不同人员：验证检验能力，过程符合，结果不符合

√ 试剂盒：取未开封试剂盒，结果不符合

√ 仪器：其他酶标仪读取，符合；原酶标仪不符合，考虑酶标仪故障。

附：重铬酸钾溶液的配制

 将重铬酸钾固体试剂放入称量瓶中（去盖）置于烘箱中，在105±5℃下烘2h后，置于干燥器内冷却30min，在分析天平上准确称取0.2829g，置于100mL烧杯中，用0.05mol/L稀硫酸溶解，移入500ml容量瓶中，以少量0.05mol/L稀硫酸洗烧杯3次，洗液并入容量瓶中，用0.05mol\L稀硫酸稀释至刻度线，摇匀。